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烏魯木齊雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)/長春染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)/西安淳風(fēng)生物科技有限公司
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烏魯木齊雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)/長春染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)/西安淳風(fēng)生物科技有限公司
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）目前由兩個(gè)主要的應(yīng)用方向，**是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計(jì)合適的microRNA質(zhì)�；蚋深A(yù)片段，同時(shí)構(gòu)建靶基因的報(bào)告基因質(zhì)粒，二者同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響（上調(diào)或下調(diào)）靶基因的**研究方法。
實(shí)驗(yàn)原理：
1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）
2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠**靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2） 設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中。
（3） 篩選陽性克隆，測序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。
（5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長24小時(shí)（80%匯合度）。
（6） 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
（7） 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測。
（8） 加入酶作用底物，于熒光計(jì)數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。
（9） 計(jì)算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否**的作用于靶基因。
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）目前由兩個(gè)主要的應(yīng)用方向，**是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計(jì)合適的microRNA質(zhì)�；蚋深A(yù)片段，同時(shí)構(gòu)建靶基因的報(bào)告基因質(zhì)粒，二者同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響（上調(diào)或下調(diào)）靶基因的**研究方法。
實(shí)驗(yàn)原理：
1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）
2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠**靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2） 設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中。
（3） 篩選陽性克隆，測序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。
（5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長24小時(shí)（80%匯合度）。
（6） 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
（7） 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測。
（8） 加入酶作用底物，于熒光計(jì)數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。
（9） 計(jì)算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否**的作用于靶基因。
.淳風(fēng)生物科技///烏魯木齊雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)/長春染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)/西安淳風(fēng)生物科技有限公司 |
| 名 稱： | 烏魯木齊雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)/長春染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)/西安淳風(fēng)生物科技有限公司 |
類 型：
供應(yīng)
地 區(qū)： 陜西
西安
用 戶： bennaosa1206
日 期： 2018-05-23 18:17:56
發(fā)布IP： 39.68.4.55 |
[參考圖片]
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